色譜柱可分為填充柱和開管柱兩大類。多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤管形、U形管等形狀。液相色譜通常均采用填充柱。色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相，以及色譜柱的制備和操作條件。
1.網上對柱子是否可以反沖一直有爭論，那什么樣的柱子可以反沖，什么不可以。反沖后是正著用，還是反著用。具體到各型號柱子不僅是ODS柱，其他如，正向柱、氨基柱、離子交換柱等。
答：一般的正相反相柱應該都能反沖，只有兩端篩板孔徑不對稱的柱子不能反沖，不過目前這樣的柱子已經比較少見了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉，反沖后還是正著用比較好，以免柱子的兩頭都被污染，提倡：正向使用，反向沖洗。
2.對于一根常用的C18柱，拿到一根新柱的時候應該怎樣進行活化及維護？為什么要這樣做？
答：新柱活化，實際上是一個平衡的過程，除了用流動相平衡外，有時候還必須用所測樣品對新柱進行平衡，特別是測定分子量比較高的多肽，尤其重要。因為，分子量高的物質分子，擴散速度慢，平衡所需時間也相應較長。具體平衡方式也很簡單，多進幾次樣品，直到峰面積和保留時間穩定，再進行正式進樣測定。
如果要加快平衡時間，把前面用來平衡的進樣樣品濃度加大，或者不等洗脫完成，連續進樣多針。用待測物對新柱平衡，目的是：將硅膠基質填料表面具有非特異性吸附的位點的吸附能力飽和掉。
3.氨基柱在進酸性樣品時，很傷柱子，如使用一段時間后，柱效降低，峰形改變，如何恢復？
答：氨基柱測酸性樣品，應該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會使略帶負電荷的氨基官能團質子化，導致使用一段時間后對于某些類的分析物保留性質有所改變或表現在柱效下降。建議：用5～10倍的柱體積的含0.5～1.0％NH3的乙腈-水(50：50)溶液沖洗該柱（沖洗后當然要再用不含堿的流動相洗去多余氨），之后，再進行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如，0.1％。
4.柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢？原來也討論過這個問題，有人也拆下來清洗過，但看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的篩板安裝上去。問題解決了，但使用壽命會不會減少呢？
答：柱頭污染了，就取出污染的，再裝一些填料。因為，假如你刮了些填料，那么微觀的塔板數就少了。假如你刮得不多，僅表面，可能就是一些臟物，所以，問題解決，但是，今后還會有同樣問題，影響柱效。建議還是裝一個預柱。
5.如果柱子取下來放置一段時間，需要做什么保護嗎？
答：對一般的反相柱，洗干凈后放到純甲醇（乙腈）或者是80%左右的甲醇（乙腈）水中，然后用堵頭塞緊柱兩頭，以免保存溶劑揮發，應該不需要做特殊的保護。
6.流動相中加入適量的四氫呋喃可以改善峰形的機理是什么？
答：甲醇為質子給予體、乙腈為質子接受體、四氫呋喃是偶極溶劑，應該除了極性影響，還有另外的影響因素，至于分離機理，還是比較復雜的，不能看成是個萬能方法。
7.預柱或保護柱用還是不用的問題？
答：應該這樣說，加上保護柱，肯定有利于保護色譜柱不受一些顆粒物質的堵塞，肯定有害于分離度和柱效，因為保護柱中間有著死體積的存在但是如果保護柱接得好并且盡量控制其匹配性和經常更換，分離度和柱效應該影響并不大。頭孢類的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍，有些原料藥，可以根據色譜柱的損耗選擇添加預柱（中間是個篩板），制劑的話，如果有輔料嚴重干擾或者流動相鹽分比較大，那還是***好配個保護柱。
8.想請您具體說明一下反沖色譜柱的方法，是不連檢測器嗎？
答：反沖就是將柱子反向連到系統中。因為，有污染物反沖出來，當然不連檢測器，出液端直接接到廢液瓶就可以。
9.waters，AtlantisC18柱可以用較高比例的流動相，那么用完后應該怎么清洗？在什么體系中保存比較合適？
答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗維護：
流動相中不含緩沖鹽：分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min
流動相中含有緩沖鹽：分析完成后，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向沖洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min；（注意：甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易長菌，使用時間不可超過3天）；
水性柱保存體系也不特別：
短期保存在所用的流動相中（不含緩沖鹽），中長期保存在純甲醇（乙腈）或80%的甲醇（乙腈）/水中。
10.正相硅膠柱一般保存在什么溶劑里面比較合適？
答：短期和長期都建議保存在正相測定所用的流動相中，一般是正己烷和極少量的異丙醇。
11.多個樣品不好分離的時候，請問該怎么通過選擇合適的柱子來提高分離度？
答：提高分離度可從三個主要影響因素來考慮，柱效、選擇性和保留因子。可通過減小填料粒徑和增加柱長提高柱效；選擇性和固定相選擇以及pH條件有關，通過選擇合適的色譜柱和合適的pH，可以提高選擇性；有時候適當延長出峰時間增加保留因子，也可提高分離度。
12.我們測試樣品時，經常會關心柱壓是否太高，但是在購買色譜柱時，并沒有說每一根色譜柱的***大使用壓力是多少？針對這樣的情況，用戶怎么判斷柱壓是否超過該柱的極限？
答：裝柱時的壓力比使用時高很多，所以柱壓對色譜柱本身在使用時沒有極限問題存在，倒是一般儀器有個40Mpa的上限。如果色譜分離度還能滿足分析方法要求，柱壓只要儀器能承受就OK吧。
13.不知道流動相已走完，液相色譜柱空走了大概一晚上，請問這種情況下柱子還能用嗎？如果可以應該如何再生？
答：能用的！可能柱子里會有氣泡進去，但只要多用流動相沖沖，看到基線穩定，就沒問題了。用色譜柱的保存液低流速長時間沖洗，然后，再檢測一下柱效，看柱子是否恢復，液相***好設置一下***低壓限，這樣就不怕流動相***而會損傷色譜柱。
14.在梯度洗脫的時候，如果整個時間程序越長，保留時間的重現性越差，尤其是后出的峰重現性差更明顯，怎么盡量避免這種情況的出現，使保留時間重現性更好？
答：這個要控制好環境溫度和柱溫，易揮發的流動相要適當密封，同時，保留時間的漂移與儀器的精度也有關系。
15.一般正常使用一個C18柱能用多長時間？
答：柱壽命一般不按時間計算，按持續進樣針數比較科學。一般正常使用維護，不超過pH和溫度等范圍，C18柱能達到500～2000針進樣的壽命，視樣品干凈程度的不同而不同。
16.請問怎么測柱效？（柱子填料是SinoChromODS-BP5μm，規格4.6mm×200mm）
答：測定柱效不同公司不一樣，有用甲苯，也有用萘的。一般柱子里面有檢測報告，你按照報告里的方法做一遍就可以。
17.峰形后拖尾是什么原因造成的？
答：[柱物理損壞]色譜柱有物理損壞是造成峰形拖尾的根源。***的解決方法就是更換新柱。
[柱內填料污染]流動相和樣品中的雜質是色譜柱主要污染源。流動相所用的各種溶劑至少是分析純，盡量使用色譜純試劑。流動相所用的水***好是超純水或全玻璃器皿雙蒸水。用前先用0.45μm溶劑微孔過濾（器）過濾，除去可能存在的微粒。流動相建議現用現配，對于含鹽的溶液尤其注意長置會產生細菌或出現沉淀。此外還得保證儲存流動相的容器清潔。復雜樣品可選用0.45μm溶劑微孔過濾（器）或樣品預處理柱對樣品進行預處理，確保樣品中不含微粒雜質。若樣品不便處理，要使用保護柱。柱內填料污染時，可將柱頭螺絲卸下，用專用工具挖出柱內前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修復，或以能溶解污染物的流動相按色譜柱使用的相反方向，沖洗色譜柱（約20至30倍柱體積，或視具體情況而定；另外，此時不能接檢測器），將污染物沖出色譜柱，再按色譜柱標明的使用方向使用。
[柱進口處有異物]
當斷定是柱進口處有異物時，可將柱頭螺絲卸下，取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中，用超聲波清洗約20分鐘，再置于超純水中，并用超聲波清洗約10分鐘，重新裝入色譜柱內即可。
[樣品濃度過高致使柱超載]
樣品在柱上超載能引起峰展寬，拖尾（或伸舌）。
適當減小進樣量或樣品濃度（需要時，可提高檢測器靈敏度）直至峰形和保留時間不再改變，便可消除這種不良影響。減小進樣量還能改善其分離度。正常情況下，樣品中每種化合物在150×4.6mm柱中進樣量保持在3～50μg范圍內，不會引起明顯超載。
[樣品溶劑不對]
選擇合適的樣品溶劑，以排除不必要的干擾，***好選用流動相溶解樣品。
[柱外效應]
柱外效應（即，進樣閥、色譜柱及檢測器間的管路過長、直徑過粗、管路接頭不匹配、有死體積）是影響色譜柱柱效的主要因素之一，所以，在可能的條件下，色譜柱的兩端連接管路要盡可能短，連接管內徑盡可能細小，切口務必平整光滑，盡可能的減小死體積，以防止因樣品擴散造成不能反映色譜柱真實柱效等情況發生。
[緩沖不足或不合適]
在緩沖不好或離子強度過低的分離中，也會出現保留時間重現性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度（與樣品大小相匹配）能改善此情況。
[硅醇基團作用]仔細分析色譜柱內填料表面性質可知：反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半，其余的就是未被鍵合的硅醇基團。所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結果。但是，酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團或金屬雜質之間相互作用而引起雙重保留機理，因此，發生了峰形拖尾。
為了減小峰形拖尾，通常可在流動相加入25mM三乙胺（抑制劑）。三乙胺能與硅醇基團發生強烈的相互作用，從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團的作用，以保證保留機理正常進行，并大大緩解了峰形拖尾。使用長鏈的硅醇基抑制劑，雖起效較慢，但，持續力較三乙胺長。因為抑制劑分子中除了胺基與硅醇基團發生極性作用外，大分子中非極性部分與固定相也會發生反相作用而產生保留現象。如果，將抑制劑加至樣品中，效果會顯著。
[柱內金屬污染]
柱內金屬污染（Fe，Ni等）可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進，也可由腐蝕性流動相緩慢溶解柱進口的金屬濾片，隨流動相沉積到柱填料中，例如，C18柱填料被金屬污染后，造成酸性/堿性樣品拖尾，可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料，得到的峰是尖銳且對稱的。
18.哪些原因會造成色譜峰變寬、峰高變低，有哪些解決辦法？
答：確實是這樣，如果其它色譜條件沒有改變，柱效下降是導致峰變寬的主要原因。對于易電離的極性物質，如果流動相pH選擇不合適，分析物既有中性分子態存在，又有離子態存在，峰也會變寬變矮。
色譜柱使用后柱效逐步下降是正常現象，如突然降低則屬異常。柱效下降原因有很多，但柱效快速下降則多半是使用不當，造成填料特性或柱床結構改變所致。如超過使用pH范圍造成的固定相和硅膠基體的流失、柱床塌陷等；還有強保留物質吸附在填料表面，形成非特異性吸附層，完全改變了原有固定相的表面活性和分離性能，使柱效下降；另外進樣時的壓力脈沖，也會破壞柱床結構影響柱效。
參考文獻來源于：制藥微生物檢測。
質量控制部
2019年08月02日
